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Abhishek Sharma

• Kinetic assays to probe the protein aggregation pathways are mainly conducted \(\textit {in vitro}\). However, it is known that the cellular factors such as molecular chaperones or osmolytes modulate aggregation. In this study, I introduce a new technique to study huntingtin exon-1 aggregation kinetics directly inside the living cells with high spatio-temporal resolution. An infrared laser is used to selectively heat single cells in culture in a stepwise manner with high precision. The cellular perturbation by temperature is simultaneously recorded by spatially resolved fast FRET imaging. The stepwise heating protocol (temperature jumps) is observed to significantly accelerate the overall aggregation. For the first time the temporally resolved sigmoidal aggregation kinetics within the cell at each single aggregating locus is recorded. I find nucleation being the most accelerated step in the aggregation pathway the stochasticity of which is significantly reduced upon heating.
• Kinetische Experimente zur Untersuchung der Protein Aggregation werden hauptsächlich \(\textit {in vitro}\) durchgeführt. Es ist jedoch bekannt, dass zelluläre Faktoren wie Chaperone oder Osmolyte die Aggregation modulieren können. In dieser Studie stelle ich eine neue Technik vor, um die Aggregationskinetik von Huntingtin exon-1 in lebenden Zellen mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung zu untersuchen. Zum Erhitzen werden gezielt einzelne Zellen mit einem Infrarotlaser bestrahlt. Die Laserleistung wird dabei stufenweise erhöht. Temperaturveränderungen innerhalb der Zelle können mit Hilfe eines ortsaufgelöstem FRET-Signals untersucht werden. Das stufenweise Aufheizen der Zelle (temperature jumps) führt dabei zu einer signifikanten Beschleunigung der Aggregation von Huntingtin exon-1. Zum ersten Mal wurde im Rahmen dieser Studie eine zeitlich aufgelöste sigmoider Aggregationskinetik innerhalb einer lebenden Zelle aufgezeichnet.